促甲状腺素受体抗体（TRAb）的检测方法

促甲状腺素受体抗体（TRAb）是Graves病（GD）的特异性生物标记物，对于GD的诊断、判断病情活动、评价停药时机、预测复发等方面具有重要的临床意义。目前促甲状腺受体（TSHR）抗体的检测方法主要有受体分析法和生物分析法两大类。相比于生物分析法，受体分析法操作更简单，技术要求低，检测时间短，更适用于临床检测。生物分析法则能区分甲状腺刺激抗体（TSAb）和甲状腺刺激阻断性抗体（TSBAb），具有一定的临床研究意义。

1. 促甲状腺受体抗体（TRAb）的受体分析法

受体分析法设计原理是基于TSHR抗体（即TRAb）能与促甲状腺激素受体（TSHR）发生特异性结合。常见的受体分析法有放射免疫法（RRA）、酶联免疫法、免疫荧光法和化学发光法（ECLIA）。其中ECLIA检测速度快、易操作且无放射污染，已实现了全自动化，适合广泛应用于临床。受体分析法的局限性在于仅能检测TRAb总和，无法区分TSAb和TSBAb。

1.1 放射受体分析法（RRA）

RRA分竞争性和非竞争性结合分析方法两类。竞争法是利用TSHR抗体能与¹²⁵I-TSH竞争性结合到TSHR的原理，当¹²⁵I-TSH的量固定不变时，¹²⁵I-TSH与TRAb竞争性地和一定量的TSHR发生可逆的特异性结合，随着样本中TRAb量的增加，¹²⁵I-TSH-TSHR复合物的量减少。经PEG沉淀离心得到¹²⁵I-TSH-TSHR复合物，通过¹²⁵I放射强度评价TRAb对125I-TSH与促甲状腺激素受体（TSHR）结合的抑制效率。非竞争法是利用TSHR抗体的Fab片段与TSHR结合，Fc片段能与¹²⁵I标记的葡萄球菌A蛋白结合形成放射性三联复合物，TRAb的量与三联复合物的量呈正相关，用TRAb活性指数来表示其结果。

RRA法的关键在于制备高活性的可溶性TSHR，可溶性TSHR可以避免正常IgG及未提取血清的非特异性干扰。但RRA一般使用PEG对抗原/同位素标记物的复合物进行沉淀、离心，在没有TRAb的情况下，PEG可以把少量未与TSHR结合的¹²⁵I-TSH沉淀下来，造成本底信号高，检测灵敏度降低，无法检测出TRAb水平较低的患者。

1.2 酶联免疫吸附法 ( ELISA)

非竞争法ELISA是通过血清中TSHR抗体与固相载体表面固定的TSHR结合后，再与酶标记的抗人免疫球蛋白（二抗）结合，加入酶反应底物后，催化产生有色产物，有色产物的量与检测的TRAb量呈正相关，将患者样本与正常样本作对比，根据颜色反应的程度进行定量分析。竞争法是利用TRAb可抑制酶标记的TRAb与固相载体表面固定的TSHR结合，加入酶反应底物后，催化产生有色产物，有色产物量与TRAb的量呈负相关。

1.3 流式细胞术

通过血清中的TRAb与表达人TSHR的细胞结合后，再与荧光素标记的抗人IgG（二抗）结合，用流式细胞仪来检测，阳性细胞结合的百分数。以不加血清的样本为阴性对照，分别测定正常样本和病人样本对TSHR的结合。结果以正常人阳性细胞结合百分数的x±2s为正常范围。

1.4 直接结合分析法

采用人工合成TSHR外功能区（TSHR-289）多肽片段（抗原）和生物素酰基化该抗原的单克隆抗体。利用TSHR抗体可抑制TSHR与生物素酰基化单克隆抗体的结合，TSHR-289片段与TRAb直接结合，比色法检测其光密度（OD）值，以正常人IgG结合后的OD±2S为正常范围。直接结合分析法无需提取TSHR，避免使用不同种属的TSHR引起所检TRAb活性不同，但该方法不适用于大量样本的检测。

1.5 化学发光法（ECLIA）

竞争法一般是利用TSHR抗体可抑制钌复合物/碱性磷酸酶/吖啶酯标记的TSHR抗体与TSHR-生物素-链霉亲和素-磁珠复合物结合，化学发光的信号强度与TRAb浓度呈负相关。非竞争法一般是通过血清中TRAb与TSHR-生物素-链霉亲和素-磁珠复合物结合，再与吖啶酯/碱性磷酸酶标记的抗人IgG（二抗）结合，化学发光的信号强度与TRAb浓度呈正相关。

2. 促甲状腺受体抗体（TRAb）的生物分析法

生物分析方法是根据不同类型的TSHR抗体与细胞表面的TSHR结合，能引起不同生物学效应，来区分TSAb和TSBAb。TSAb与TSHR结合后，刺激细胞，能引起细胞内cAMP水平升高；而TSBAb与TSHR结合后，阻断外源性TSH与TSHR结合，能引起细胞内cAMP水平下降。与受体分析法相比，生物分析方法操作繁琐，技术要求较高，检测时间长，成本偏高等。但从生物分析方法对TRAb的区分能力看，这类检测方法更具临床意义, 值得进一步研究。

2.1 cAMP生物分析法

cAMP生物法通常是用聚乙二醇（PEG）粗提法，提取待测血清中的IgG，用以刺激处于生长对数期的中国仓鼠卵巢细胞 ( CHO) -TSHR细胞系，最后使用放射免疫分析或酶联免疫法测定cAMP浓度。TSAb活性以待测样本中细胞系产生的cAMP相对于正常对照的百分数表示，TSBAb活性以待测样本对一定浓度的外源TSH诱导产生cAMP的抑制率表示。cAMP生物法存在较大的细胞组间差异，细胞培养条件高，限制了其在临床的广泛应用。

计算公式：TSAb活性=A/B×100%；

TSBAb活性=[ 1-( C-A) /( D-B) ] ×100%；

其中A：待测组（不含外源bTSH）产生的cAMP，B：正常对照组 (不含外源bTSH)产生的cAMP，C：待测组（含外源bTSH）产生的 cAMP，D：正常对照组（含外源bTSH）产生的cAMP。

2.2 化学发光生物法

化学发光生物法是将带有cAMP反应元件（CRE）和编码萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒转染到表达人TSHR的中国仓鼠卵（CHO）细胞中，当TSAb作用于TSHR时，激活cAMP途径，CRE和其下游的荧光素酶基因表达，产生荧光；而TSBAb不能激活cAMP途径产生荧光，以此区分TSAb与TSBAb。

2.3 TSHR-LH/CGR嵌合体 -cAMP法

TSHR胞外区相应序列的残基被促黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体（LH/CGR）部分残基取代，构建出仅有TSAb表位或仅有TSBAb表位的嵌合体细胞，通过测定细胞受血清IgG刺激后cAMP表达水平，来区分TSAb与TSBAb。

参考文献

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