猴痘病毒（MPXV）的基因组分析

猴痘病毒（MPV）属于痘病毒科正痘病毒属，可引起一种类似于天花的人类疾病。对MPV基因组196858bp进行了结构特征和开放阅读框分析，基因组的每一端都包含一个完全相同但方向相反的长为6379bp的末端反向重复序列、一个假定的端粒分辨序列和短串联重复序列。MPV包含已知正痘病毒的基本基因，但只包含免疫调节和宿主范围基因的一个子集。序列比较证实MPV是一种独特的正痘病毒，不是天花病毒的直系祖先或直系后代。

1. 简介

痘病毒科由复杂的双链DNA病毒组成，其特点是在脊椎动物或无脊椎动物细胞的细胞质中复制。痘病毒属于正痘病毒属，包括天花病毒（VAR）、猴痘病毒（MPV）、牛痘病毒（CPV）和痘苗病毒（VAC）。VAR是人类天花的病原体，天花是一种死亡率为10%-40%的传染病，通过活体VAC预防性接种战略性消除了天花。根除天花后，停止接种疫苗，导致对其他正痘病毒的免疫力下降。因此，现在人们对MPV、CPV和VAC等人畜共患病毒的易感性增加。这些病毒在人群中潜在传播可能导致其致病性或传染性的适应性增加。

猴痘和天花的相似临床表现导致了MPV是VAR进化祖先的假说。根据基因组限制性内切酶图谱或单个病毒基因的核苷酸序列比较VAR和MPV分析MPV和VAR的进化图谱。对人类MPV分离株ZAI-96-I-16 （MPV- ZAI）进行了DNA测序，通过比较全基因组，得出结论：MPV不是VAR的直系祖先或后代。对MPV-ZAI的DNA序列进行了详细分析，并与VAC、VAR相应的全基因组序列和CPV的部分序列进行了比较，发现该序列包括除部分共价末端发夹环外的整个基因组。

2. 基因组图谱

正痘病毒基因组的末端包含一个完全相同但方向相反的序列，称为末端反向重复序列（ITR），其中包括一组短串联重复序列和末端发夹。MPV-ZAI基因组包含一个6379bp的ITR。通过S1核酸酶水解和DNA聚合酶Ⅰ聚合，成功克隆了MPV-ZAI DNA中两条互补的、不完全碱基配对的发夹环链之一。该序列与其他正痘病毒的序列比对表明，该序列具有相当大的保守性，并只缺失组成环的四个核苷酸（图1）。

图1. MPV与其他正痘病毒末端区域的比较

注释：上行显示了MPV-ZAI终端循环的排序部分。核苷酸与VAC-WR序列不同。ZAI、BSH和WR分别代表Zaire-96-I-16、孟加拉国和西部保护区的病毒株。

MPV的端粒解析序列与VAC、VAR相同。MPV-ZAI基因组末端发夹附近的串联重复序列区域较短，由NR Ⅰ（85bp）和NR Ⅱ（322bp）组成。MPV-ZAI DNA这一区域的组织结构与VAR-GAR最相似（图2）。然而所有VAR毒株的末端区域都有非常短的ITR，缺少ORF，并且左右末端的重复序列集不同。

图2. MPV和其他正痘病毒ITR区域内串联重复模式

注释：白色矩形表示独特的ITR序列：NR I和NR II以及编码区。黑色菱形对应于70个碱基的串联重复序列，其数量如上所示。灰色三角形对应于54个碱基的重复序列，其数量如下所示。VAc-COP和VAc-WR ITR序列中的五边形表示125个碱基的重复。开放的方块和三角形表明，这些重复序列通过删除、替换或插入而不同于共识序列。黑色的圆圈表示末端的发夹。虚线表示缺少相应的DNA。

3. 编码区

MPV-ZAI基因组左侧的四个ORF（图3A）位于ITR内，因此在基因组右侧也有对应的ORF（图3B）。所有已知在其他正痘病毒中至关重要的基因都存在于MPV中，并占据基因组的中心区域（ORFs C10L到A25R）。这些ORF与其他正痘病毒的序列同源性大于90%。MPV-ZAI与正痘病毒之间的大多数物种和毒株特异性差异存在于左侧和右侧的末端区域（图3A和图3B）。MPV-ZAI缺少CPV-GRI中发现的25个ORF和VAR-IND的19个潜在ORF。虽然其中一些基因的作用仍然未知，但它们可能包括许多涉及免疫逃避、宿主范围和细胞增殖的基因。

图3. MPV左侧(A)和右侧(B)末端可变区内的ORF与其他正痘病毒相应基因组片段的比对

注释：ORF的大小和方向用箭头标出。一种病毒的DNA和蛋白质相对于另一种病毒的缺失，分别超过150bp和50个氨基酸，用圆点标记。黑色方块标记ITR区域内的序列。核苷酸编号显示在右边。

之前比较了MPV和VAR两类基因，在表1. 中添加了VAC和CPV的生长因子和免疫逃避基因，后者包含了正痘病毒中存在的所有此类已知基因。根据完整且未被广泛截断的毒力基因的数量（括号中所示），得到：CPV-GRI（17）＞VAR-IND（11）=VAR-GAR（11）＞MPV-ZAI（10）＞VAC-COP（9）＞VAC-MVA（6）。因此，MPV-ZAI也比CPV含有更少的锚蛋白重复基因。

注释：*表示在左侧和右侧反向末端重复区域（ITR）中复制的ORF。与CPV-GRI的相应ORF在功能上有重要差异的ORF用†表示。

CPV-GRI编码Kelch族6-500个功能未知的氨基酸，彼此之间的相似性为22-26%。虽然VAC-COP编码3个Kelch族蛋白，与CPV-GRI蛋白同源性分别为99.4%、97.9%和98.6%，但MPV-ZAI基因组只编码1个C9L，与CPV-GRI蛋白G3L同源性为97.3%。在VAR的基因组中，这些ORF似乎都被破坏了，这表明它们在复制中不是必需的。

VAC含有两个带有磷脂酶D序列的ORF：F13L是形成细胞外病毒和有效的细胞间感染传播所必需的，而K4L对于组织培养中的复制是必不可少的。MPV-ZAI包含这三个ORF的完整版本（C4L、C5L和C19L），而VAR株由于DNA片段的缺失而缺乏C4L和C5L同源物（图3A）。C4L和C5L蛋白的功能尚不清楚，但它们都是由MPV和CPV这两种正痘病毒编码的且宿主范围相对较广。

4. 系统发育分析

根据末端可变区DNA序列，认为CPV的组织结构与祖先的正痘病毒种类最为相似，VAR与MPV的距离比VAC的略远。然而，通过分别分析左侧和右侧的可变区，情况似乎更加复杂。VAC毒株似乎比他们的左侧更接近MPV-ZAI末端可变区和VAR菌株相对于右侧末端可变区（图4），这种差异可能是由于VAC的复杂重组起源引起的。

图4. 系统发育分析

5. 总结

综上所述，MPV的基因组似乎是典型的正痘病毒，它包括一个中央保守区，更多可变的左端和右端区域，以及一个具有串联重复的ITR。对MPV、VAR、CPV和VAC基因组的比较分析证实，MPV是一个离散的物种，表现出与其他致病的正痘病毒的多种不同。由于VAC有复杂重组的起源，所以物种之间的重组是可能的，正痘病毒很可能是从类似牛痘的祖先病毒独立进化而来。

参考文献

Shchelkunov SN, Totmenin AV, Safronov PF, et al. Analysis of the monkeypox virus genome[J]. Virology. 2002, 297(2): 172-194.

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