化学发光酶免疫分析（CLEIA）发光原理

化学发光酶免疫分析（Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是将高灵敏度的化学发光检测技术与高特异性的酶免疫分析技术相结合，用于检测微量物质的免疫检测技术。CLEIA反应基本原理是用参与催化某一发光反应的酶来标记抗体（或抗原），在抗原-抗体反应后加入化学发光底物，酶催化和分解底物发光，用光检测仪检测发光强度，最后通过标准曲线，根据光强换算出被测物的浓度。CLEIA常用方法包括：用于大分子抗原检测的双抗体夹心法、用于抗体检测的双抗原夹心法，和用于多肽类小分子抗原测定的竞争法。根据标记酶和酶促化学发光底物的不同CLEIA又可以分成不同的反应体系，其中辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）作为标记酶的CLEIA反应体系是最为常见的。

ALP标记的化学发光酶免疫分析

碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）是一种分子量为80kD或100kD的磷酸单酯水解酶，可从大肠杆菌或小牛肠黏膜提取获得。ALP最适pH为9.6（肠黏膜）或8.0（菌源性），在碱性环境中能够将底物去磷酸化。碱性磷酸酶的酶促化学发光底物有AMPPD（1，2－二氧环乙烷衍生物，螺旋金刚烷）、CDP Star、APS-5等，其中AMPPD是最常见的ALP酶促化学发光底物。

1）ALP-AMPPD发光体系

AMPPD中文全称为3-（2-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3-磷氧酰）-苯基-1，2-二氧环乙烷，是一种生物化学领域中超灵敏的碱性磷酸酶底物，具有底物稳定性好、反应速度快的特点。AMPPD分子结构中有两个重要部分，一个是连接苯环和金刚烷的二氧四节环，它可以断裂并发射光子；另一个是磷酸根基团，它维持着整个分子结构的稳定。碱性条件下AMPPD在ALP的作用下脱去磷酸根基团，形成一个不稳定的中间体AMPD。AMPD分子内电子转移后裂解成金刚烷酮和处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，释放出光子回到基态，产生470nm的光，持续时间可达几十分钟至数小时。
AMPPD发光原理示意图

图1. AMPPD发光原理示意图

2）ALP-CDP Star发光体系

CDP-Star中文名为2-氯-5-（4-甲氧基螺[1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-（5-氯三环[3.3.1.13.7]癸烷]）-4-基] -1-苯基磷酸二钠，是由AMPPD改进而来，对ALP标记分子的检测更灵敏，反应动力学更好。CDP-Star具有低背景、酶催化强度高、光输出时间长的特点。

图2. CDP Star发光原理示意图

3）ALP-APS-5发光体系

APS-5中文名为9-（4'-氯苯硫代磷酰氧亚甲基）-10-甲基-9，10-二氢化吖啶二钠盐，是一种基于9，10-二氢吖啶的发光底物，在ALP作用下可以持续发光。APS-5对ALP标记分子的检测灵敏，但未在ALP标记的化学发光酶免疫分析上广泛应用。

HRP标记的化学发光酶免疫分析

辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）来源于蔬菜植物辣根中，分子量为40kD，由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）结合而成。辅基是酶活性基团，最大吸收峰在403nm处；而主酶与酶活性无关，最大吸收峰在275nm。HRP常用的化学发光底物为鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）、异鲁米诺（4-氨基苯二甲酰肼）及其衍生物。用于辣根过氧化物酶（HRP）的化学发光底物多为双组分系统，稳定的H2O2和鲁米诺（5－氨基－邻苯二甲酰肼）是经典的HRP标记CLEIA反应体系。

1）HRP-H2O2-鲁米诺发光体系

鲁米诺（Luminol）又名发光氨，是一种化学荧光分子。碱性条件下，HRP催化鲁米诺和过氧化氢的氧化反应，鲁米诺与氢氧化物反应时生成了一个双负离子（Dianion），它可被过氧化氢分解出的氧气氧化，产物为一个有机过氧化物。该过氧化物立即分解出氮气（鲁米诺被有机氧化剂如二甲基亚砜氧化后不是生成氮气，而是生成含氮有机物），生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。激发态至基态转化中，释放的能量以光子的形式存在，波长位于可见光的蓝光部分，可在425nm下进行检测。
鲁米诺发光原理

图3. 鲁米诺发光原理

2）HRP-H2O2-鲁米诺-增强剂发光体系

传统的HRP-H2O2-鲁米诺CLEIA反应体系发光量低、不易测量，在发光体系中加入增强剂，鲁米诺的发光灵敏度和发光信号提高，同时发光稳定时间延长，降低氧化剂与发光剂等单独作用时出现的“本底”发光。常用的增强剂有苯酚类、芳香胺类及苯基硼酸衍生物等，其中苯基硼酸类增强剂可以和苯酚类增强剂同时加入以提高分析灵敏度。

增强剂增强原理

当等量的H2O2与HRP混合后，有活性的酶底物复合物（Complex Ⅰ）迅速形成，但Complex Ⅰ与供氢体结合形成的复合物（Complex Ⅱ）形成速度较慢，而酚类及其芳香胺类等化合物都可作为HRP的第二底物（即供氢体），使得在反应中Complex Ⅰ及Complex Ⅱ的静态浓度增大，显著加快酶的循环速度。在增强剂的作用下，HRP-H2O2-鲁米诺体系中的信号都被不同程度的增强，一定程度上解决了发光体系量子效率低、反应发光时效短等缺点，使HRP的灵敏度及精密度大大提高。
增强剂增强原理示意图

图4. 增强剂增强原理示意图

参考文献

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