新型冠状病毒（2019-nCoV）检测方法介绍-核酸检测

冠状病毒是一类具有包膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒。人体感染冠状病毒后通常引起感冒、发烧等症状，严重者能造成死亡。2020年1月于武汉发现的新型冠状病毒（2019-nCoV）是目前发现的第七种能够感染人类的冠状病毒。判定人体是否感染冠状病毒通常有三种途径，分别是对冠状病毒的编码基因（RNA）进行检测、对冠状病毒基因表达的特定蛋白（如Spike蛋白）进行检测以及对冠状病毒侵入人体后产生的IgG/IgM进行检测。本文主要对2019-nCoV核酸检测的原理及方法做一介绍。

检测原理

冠状病毒的编码基因是RNA，通过测定样本中是否含有新型冠状病毒基因，即可判断患者是否被感染。RNA检测主要依赖于逆转录实时荧光PCR（RT-PCR）技术。

逆转录实时荧光PCR技术

PCR的全称为聚合酶链式扩增技术，是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，能够实现微量DNA片段的大幅扩增。其基本原理是先将双链DNA解链为单链，随后以单链DNA为模板，借助人工合成的一段核酸片段（引物）来启动合成，最终合成新的双链DNA。在PCR反应体系中，DNA双螺旋被解链成单链后，引物与单链DNA的特定序列结合，形成一小段的双链DNA，随后在合适的温度下进行延伸，形成新的双链DNA。每经过一个循环，核酸数量就会增加1倍，经过28-35个循环，即可将微量的核酸片段变的肉眼可见。

PCR扩增流程

由于2019-nCoV的编码基因为RNA，因此需要先将RNA逆转录为cDNA，随后进行PCR扩增，该技术称为逆转录PCR。在逆转录PCR反应体系中加入荧光探针，随着PCR的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光信号，实现对逆转录PCR产物（DNA序列）的实时监测。

2019-nCoV序列的引物设计

核酸检测的准确性由引物的特异性决定，引物特异性不高会导致出现非特异性扩增，最终影响测定结果。目前核酸检测所使用的引物序列，基本都是针对病毒序列中高度保守的2至3个序列（比如编码replicase复制酶或者necleocapsid核蛋白衣的核酸序列）来进行设计。2019-nCoV的引物序列如下图所示：

核酸检测引物

检测步骤

核酸检测现主要通过检测试剂盒实现，检测步骤主要分为样本采集、RNA提取及PCR扩增三部分。

样本采集

常规的样本类型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等，依据试剂盒说明书进行样本的采集。获得样本后需尽快进行检测。

RNA提取

利用核酸提取试剂盒对RNA进行提取，空气中含有大量的RNA酶，RNA在空气中极易降解，因此需做好保护措施（如加入能抑制核酸酶活性的物质）。在提取得到RNA后需立即进行PCR扩增。

PCR扩增

最后将RNA放入PCR反应体系中进行扩增，并观察扩增结果。扩增后的核酸序列带有荧光，如果检测到荧光信号曲线符合病毒特征，那么就认为该疑似患者为阳性。在实际操作过程中，需对一位患者进行多次检测

提取病毒RNA本身也包含裂解样本，提纯RNA等多个工序，需要花费数小时。而RT-PCR一般来说也需要至少三四个小时才能完成。因此整个流程预计需要一个工作日，即6-8小时左右，检测结果都需要经过复核，重复实验则需要花费双倍的时间。

检测特点

核酸检测是分子层面上的检测，就现有所有的快速检测方法来看，这种方法检测的特异性和灵敏度都是最高的。由于这一检测方法靠的是分子层面的特异性结合，因此只要公布的基因序列没有问题，相关技术的检测准确率可以达到99.9%。

核酸检测与蛋白检测方式对比

	核酸检测	蛋白检测
准确性	依赖于引物的特异性	依赖于抗体的亲和力
待测物	RNA	蛋白
操作	需要提取RNA，流程繁琐	血清检测，流程简单
周期	长，需要6-8h	短，只需15-30min
试剂盒开发难度	难度小，开发周期短	需获得特异性抗体，难度大，开发周期长
试剂盒生产成本	低	高
试剂盒用途	新冠肺炎筛查确诊	与核酸检测联合使用，降低假阴性

参考文献

[1]. Lu H, Stratton CW, Tang YW. Outbreak of pneumonia of unknown etiology in Wuhan China: the mystery and the miracle. J Med Virol 2020; published online Jan 16. DOI:10.1002/jmv.25678.
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